查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法 100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                     

測(cè)定意義：

查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的黃酮類化合物合成相關(guān)酶，也是黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。查爾酮異構(gòu)酶和查爾酮合酶一起構(gòu)成了黃酮類化合物生物合成的限速酶。

測(cè)定原理：

查爾酮異構(gòu)酶（CHI）催化查爾酮環(huán)化形成 4,5,7-三羥基黃烷酮，通過(guò)測(cè)定381nm下的吸光度變化表示CHI的活性。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；用時(shí)加入20mL試劑一充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至381nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定表

在微量石英比色皿或96孔板中加入10µL上清液和190µL試劑二，立即混勻并記錄381nm下初始吸光值A1和37℃保溫30min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

CHI活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.1為一個(gè)酶活力單位。

CHI（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.1÷T =400×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.1為一個(gè)酶活力單位。

CHI（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.1÷T =400×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。

用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.05為一個(gè)酶活力單位。

CHI（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.05÷T =800×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)A381變化0.05為一個(gè)酶活力單位。

CHI（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.05÷T =800×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。