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所有試劑、酶標(biāo)板提前室溫平衡30min；未使用的酶標(biāo)條密封放回鋁箔袋（含干燥劑）。
二、完整操作步驟（96孔板通用）
加樣（標(biāo)準(zhǔn)品+待測樣本）
設(shè)置：7個梯度標(biāo)準(zhǔn)品孔、1個空白零孔、待測樣本孔（建議復(fù)孔）。
每孔加入100μL梯度標(biāo)準(zhǔn)品/稀釋后小鼠血漿，空白孔加等量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；貼封板膜，37℃避光孵育60min。
孵育結(jié)束后，甩干孔內(nèi)液體，拍干吸水紙，暫不洗板。
一抗（生物素化檢測液A）孵育
每孔加100μL 1×檢測液A，封膜，37℃避光孵育60min。
洗板3次
每孔加300μL 1×洗滌液，浸泡30s后甩干，板底吸水紙用力拍干；重復(fù)洗滌3次，無殘留氣泡、液體。
酶結(jié)合物（檢測液B，HRP）孵育
每孔加100μL 1×檢測液B，封膜，37℃避光孵育30min。
洗板5次
同上洗滌操作，增加洗滌次數(shù)，徹d去除未結(jié)合HRP，拍干。
TMB底物顯色
每孔加90μL TMB底物，封膜，37℃避光顯色10–20min；肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品孔梯度藍色，最深孔不發(fā)黑即終止。
終止反應(yīng)與讀數(shù)
按加底物順序，每孔快速加50μL終止液（稀硫酸），溶液由藍變黃；5min內(nèi)酶標(biāo)儀450nm測OD值，可搭配630nm參比濾光片校正背景。
三、結(jié)果計算
每孔OD減去空白零孔OD，取復(fù)孔平均值。
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸、校正OD值為Y軸，用四參數(shù)Logistic模型繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)樣本OD值代入曲線，算出稀釋后濃度；最終濃度=曲線讀數(shù)×樣本稀釋倍數(shù)。
若樣本OD超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最高值，需加大稀釋倍數(shù)重測。
四、凝血因子活性試劑盒（凝固法）簡易操作（補充）
若檢測因子促凝活性（F:C），采用APTT凝固法，流程不同：
試劑：待測因子缺乏血漿、APTT激活劑、0.025mol/L CaCl?、校準(zhǔn)血漿。
體系：50μL稀釋小鼠血漿+50μL缺因子血漿+50μL APTT試劑，37℃溫育10min。
加入50μL預(yù)熱CaCl?，同步計時，記錄凝固時間。
校準(zhǔn)血漿倍比稀釋，凝固時間-活性對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算小鼠血漿凝血因子活性百分比。
五、關(guān)鍵注意事項
全程避免酶標(biāo)孔干涸，洗板后立刻進行下一步；移液器吸頭每孔更換，防止交叉污染。
TMB底物避光保存，變藍、渾濁即失效；終止液強酸，避免皮膚接觸。
血漿溶血、脂血、黃疸會嚴重干擾OD值，不合格樣本棄用。
孵育溫度嚴格37℃，避光；孵育不足/超時均會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。
所有操作避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會大幅干擾吸光度讀數(shù)。
試劑盒組分不可混用不同批次，過期試劑禁止使用。
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更新時間：2026-06-17
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